Tadeusz Przemysław Trzmiel - Enzymy przemysłowe.doc

Tadeusz Trzmiel

Instytut Biochemii Technicznej

Enzymy przemysłowe

   (2008)

SPIS TREŚCI

1. Hydrolazy peptydowe

2. Endopeptydazy bakterii z rodzaju Bacillus

3. Kierunki wykorzystania endopeptydaz

4. Lipazy

EC 3.4. Hydrolazy peptydowe

EC 3.4.11.- 3.4.19. Peptydazy

EC 3.4.11. aminopeptydazy (hydrolazy a-aminoacylopeptydowe)

metaloenzymy (Zn, Ca),

niektóre wysoce specyficzne -np. z E.coli odrywają prolinę, argininę

z Costridium - pozakomórkowe!, aminopeptydaza I B.thermoproteolyticus

EC 3.4.16.-18. karboksypeptydazy (hydrolazy peptydyloaminoacylowe)

usuwają C-terminalny aminokwas

16. serynowe karboksypeptydazy

u wielu drobnoustrojów

szeroka specyficzność

pH= 4,5- 6,0

17. metalokarboksypeptydazy

podobne do karboksypeptydazy A

18. tiolowe lub cysteinowe

u Clostridium

EC 3.4.13 dipeptydazy (hydrolazy dipeptydowe)

powszechne u bakterii

niektóre wysoce specyficzne (np. karnozinaza- aminoacyl-histydyna)

centrum aktywne i warunki działania zróżnicowane

EC 3.4.14 peptydazy dipeptydylowe (dipeptydylopeptydazy )

usuwają N-terminalne dipeptydy

w centrum aktywnym -SH,  podobne do katepsyny C

występują rzadko u bakterii

EC 3.4.15. karboksypeptydazy dipeptydylowe (peptydylo dipeptydazy)

usuwają N-terminalny dipeptyd

metaloenzymy (Zn) u E.coli cynkoglikoproteid

EC 3.4.19. Omegapeptydazy u B.subtilis !

odrywają aminoacyloacyl N-acetyl, N-formyl

EC 3.4.21.-3.4.99. Endopeptydazy

EC 3.4.21. Endopeptydazy serynowe

a) trypsynopodobne   (u Streptomyces)

pH=8, pI=9, M=20000

specyficzność: Arg, Lyz (2 miejsca)

b) alkaliczne proteinazy  (szeroko rozpowszechnione)

pH >10, pI=10, M= 15-30 tys.

brak cysteiny

specyficzność szeroka: aromatyczne, hydrofobowe (Leu, Tyr, Fen, )

  1) subtilizyny Carlsberg i Novo

w 7 miejscach

  2) subtilizyno-podobne (Streptomyces, Arthrobacter)

w 11 miejscach

  3) wewnątrz komórkowe (np. endopeptydaza W, Bacillopeptydaza F)

wysoka aktywność esteraz

4) inne (np. z B.pumilis - hybryd, keratynaza ze Streptomyces fradie)

c) a-lityczne proteinazy (z Myxobacter)

elastazo- podobne

pH= 9, M=20000

specyficzność: Wal, Ala

brak aktyw. esteraz

d) proteinazy Staphylococus

pH= 3,5- 9,5 (hemogl.7,8), M= 12000

specyficzność: kw.Asp, Glu

e) proteinazy inne (np. z Gram - bakterii)

EC 3.4.22. Endopeptydazy tiolowe (u roślin)

a) Clostridiopeptydaza B

pH= 7, pI= 4,8, M= 50000

wrażliwa na czynniki redukujące HCN, cysteinę

specyficzność: jak trypsynopodobne

b) ze Streptpcocus  papaino-podobne

pH=7,5, pI=8,4, M=32000

specyficzność: b.szeroka, w 10 miejscach identycznie jak papaina

EC 3.4.23. Endopeptydazy aspartylowe (kwaśne)

u pleśni i drożdży  u B.cereus  pepsyno-podobna

pH=3,5,  pI= 4,3  M= 33000

specyficzność: Tyr, Fen z obu stron

EC 3.4.24. Metaloendopeptydazy

a) proteinazy obojętne

szeroko rozpowszechnione u bakterii

pH = 7, pI= 4-9, M=35-40000

w centrum katalitycznym Zn

specyficzność: 6 miejsc (Leu, Fen)

hydrolizują syntetyczne substraty

u rodzaju Bacillus kilka odmian (m.in. termolizyna, megateriopeptydaza

b) metaoloproteinazy alkaliczne

u bakterii G-, Pseudomonas (kolagenazo-podobne)

pH= 7-9, pI=5,5, M= 50-60000

w centrum Zn, Ca,

specyficzność: 3 miejsca (Asp, Glu, Cys-SO H)

hydrolizują syntetyczne substraty

c) proteinazy α-lityczne (z Myxobacter)

u Arthrobacter

pH= 9, M= 14000

d) proteinazy nielityczne z Myxobacter

pH= 9, M= 17000

EC 3.4.25.Endopeptydazy treoninowe

2. Endopeptydazy bakterii z rodzaju Bacillus 

W tabeli 1 wyszczególniono najważniejsze ze znanych obecnie endopeptydaz (proteinaz) otrzymywanych z podłoży po hodowli bakterii z rodzaju Bacillus. Wszystkie są endopeptydazami serynowymi lub też metaloendopeptydazami. Jedynie wyjątkowo w filtratach pohodowlanych B.cereus znaleziono proteinazę aspartylową.

Tabela 1.Pozakomórkowe endopeptydazy bakterii z rodzaju Bacillus

Spośród serynowych endopeptydaz bakterie Bacillus wytwarzają głównie subtilizyny, subtilizyno-podobne enzymy i proteinazy wewnątrzkomórkowe (np. bacillopeptydazę F czy proteinazę W1). Do nielicznych należą szczepy produkujące proteinazy trypsyno- lub elastazopodobne.

Endopeptydazy serynowe wewnątrzkomórkowe charakteryzują się wysoką aktywnością esterolityczną, niskim pI, ścisłą zależnością od Ca+2 przy niewysokiej aktywności w stosunku do substratów białkowych.

Subtilizyny (EC 3.4.21.62.) występują w kilku odmianach różniących się właściwościami fizyko-chemicznymi (m.in. optymalnym pH, masą cząsteczkową, punktem izoelektrycznym, składem aminokwasowym, a także zdolnością do hydrolizy syntetycznych substratów). Dzieli się je na dwie grupy:

a) subtilizyny typu Carlsberg (dawniej subtilopeptydazy A), obejmujące alkaliczne proteinazy B.pumilus i B.licheniformis.

b) subtilizyny typu BPN` (dawniej subtilopeptydazy B), obejmujące subtilizyny BPN` i Novo, a także alkaliczne proteinazy B.subtilis NRRL B-3411 i B.subtilis var. amylosacchariticus.

Alkalofilne szczepy Bacillus, produkują subtilizyno-podobne proteinazy, odbiegające nieco właściwościami od typowych subtilizyn. Enzymy te wyróżniają się wysoce alkalicznym optimum pH działania, sięgającym nawet 11-12. Szczepy wytwarzające te enzymy (np. B.alcalophilus) rosną przy pH wyższym od 10. Niektórzy uważają, że enzymy te są pochodnymi subtilizyny Carlsberg. Jednakże własności immunologiczne alkalicznej serynowej proteinazy wytwarzanej przez B.alcalophilus subsp. haloduram odbiegają od własności subtilizyny Carlsberg i BPN`.

Pomimo wspomnianych różnic, wszystkie subtilizyny mają identyczne centrum aktywne, w którym decydującą rolę odgrywa seryna i przejawiają identyczny mechanizm działania. Wszystkie też ulegają całkowitej inhibicji przez DFP, który reaguje z seryną centrum aktywnego. Obok seryny, ważną rolę w ich funkcjonowaniu odgrywa histydyna znajdująca się w pozycji 64 oraz kwas asparaginowy w pozycji 32.

Optimum pH subtilizyn różni się nieco dla obu odmian enzymu (rys.2). Subtilizyny typu Carlsberg wykazują optimum pH równe 10,6 z zachowaniem 50% aktywności w pH 7,5. Subtilizyny typu BPN` charakteryzują się bardziej płaskim profilem zależności aktywności od pH w przedziale 7-10. Optimum wynosi 10,2 z zachowaniem 78% aktywności w pH 7,5.

Rys. 2. Wpływ pH na aktywność subtilizyn

Subtilizyny znane są z niewrażliwości ich struktury na obecność związków denaturujących. Utrzymują aktywność proteolityczną i esteraz w stężonych roztworach mocznika, etanolu czy dioksanu, nie tracą również aktywności w środowisku silnie alkalicznym, w obecności detergentów, wybielaczy tkanin i środków piorących. Subtilizyny wykazują szeroką specyficzność substratową. Rozszczepiają ponadto estry różnych N-acetylowanych i N-benzoilowanych aminokwasów.

W celu lepszego poznania podstaw funkcjonowania subtilizyn, podejmowano próby zbadania ich struktury.

Wright i wsp. podjęli badania nad ustalenia struktury przestrzennej subtilizyn BPN’ i Novo z użyciem metody rentgenograficznej. Z kolei, Bode  oraz McPhalen [26, 27] starali się określić strukturę krystaliczną subtilizyny Carlsberg (w kompleksie z inhibitorem o nazwie eglin C, izolowanym z pijawki lekarskiej) również metodą krystalografii rentgenowskiej. Strukturę trójwymiarową proteinazy alkalostabilnej PB 92 ustalili van der Laan i Dijkstra.

Ich badania ujawniły, iż struktury tych enzymów wykazują wysoki stopień podobieństwa.

Subtilizyny są białkami globularnymi. Centrum aktywne ulokowane jest w stosunkowo płytkim zagłębieniu na powierzchni cząsteczki.

W subtilizynach BPN’, Novo oraz Carlsberg wyróżniono siedem odcinków struktury równoległej β znajdujących się w centrum cząsteczki oraz dziewięć odcinków α‑helisy. Dwie z nich są ukryte we wnętrzu cząsteczki, pozostałe siedem (amfipatycznych) leży na jej powierzchni. Zauważono, jednakże, że istnieją pewne niewielkie różnice pomiędzy subtilizynami BPN’, Novo oraz Carlsberg w pozycji zajmowanej przez jeden z zewnętrznych łańcuchów α-helikalnych wynikającą z odmiennego składu aminokwasowego.

Proteinazę alkalostabilną PB 92 tworzy dziewięć nici β i siedem struktur α-helikalnych. Tak jak w przypadku wyżej opisanych subtilizyn, siedem odcinków struktury równoległej β oraz dwie α-helisy stanowią centrum molekuły zamknięte przez pięć amfipatycznych α-helis i dwa odcinki przeciwrównoległe β.

Subtilizyny wykazują zdolność do wiązania przynajmniej dwóch jonów Ca2+, a dwa miejsca wiążące te jony są usytuowane podobnie w każdej z nich. Martin, Mulder i wsp.[23] podjęli próby zbadania struktury proteinazy PB 92 w roztworze przy użyciu spektroskopii NMR. Wyszli oni z założenia, iż uzyskane tą metodą dane mogą dostarczyć więcej informacji o mechanizmach funkcjonowania subtilizyn, tym bardziej, że w formach krystalicznych tych enzymów, w ich miejscach wiążących obecne są pewne zniekształcenia. Ich obecność może być przyczyną zafałszowania rzeczywistych informacji na temat tych kluczowych regionów cząsteczek subtilizyn.

Wykazali oni, iż struktura proteinazy alkalostabilnej w roztworze jest sztywna, wyjąwszy określoną liczbę miejsc. Wśród nich znajduje się miejsce wiążące substrat. Mobilność miejsca wiążącego potwierdza zaproponowany wcześniej mechanizm indukowanego dopasowania do substratu.

Subtilizyny znane są z niewrażliwości ich struktury na obecność biopolimerów denaturujących. Utrzymują one aktywność proteolityczną i esterazową w stężonych roztworach mocznika, etanolu, dioksanu czy chlorowodorku guanidyny. Subtilizyny nie tracą aktywności w środowisku silnie alkalicznym, w obecności detergentów, wybielaczy tkanin i środków piorących. Subtilizyny wykazują szeroką specyficzność substratową. Rozszczepiają one estry różnych N-acetylowanych i N-benzoilowanych aminokwasów.

W literaturze opisano przykłady wykorzystania subtilizyn jako katalizatorów w reakcjach syntez różnorodnych związków. We wczesnych etapach rozwoju biotechnologii uznawano, że enzymy te mają niewielki potencjał syntetyczny. W środowisku wodnym równowaga rzeczywiście przesunięta jest na korzyść hydrolizy. Jednakże zmiana warunków środowiska reakcji poprzez dodanie rozpuszczalników organicznych i jednoczesne obniżenie zawartości wody, może przesunąć równowagę reakcji tak, aby uzyskać użyteczną proporcję produktów syntezy.

...