Podstawowe metody i technik stosowqne w enzymologii - izolowanie, oczyszczanie i charakteryzowanie białek (enzymów).©
Izolacja białek
1. Głowne zajęcie biochemików i biologów molekularnych
2. Tysiące procedur oczyszczania białek opisanych w publikacjach naukowych
3. BRAK JEDNEJ WSPÓLNEJ RECEPTURY OCZYSZCZANIA
Etapy izolacji i oczyszczania (preparatyki) białek
4. Homogenizacja materiału badawczego - dezintegracja komórek
5. Wirowanie bądź ultrawirowani
6. Wstępne oczyszczanie
7. Chromatografia (selektywne metody frakcjonowania)
8. Elektroforeza (selektywne metody frakcjonowania)
Stabilizacja białek podczas całej procedury izolacji i oczyszczania:
9. Środowisko wodne (obecność soli, glicerol lub sacharoza - 10℅ kiedy izolujemy białka błonowe) wsalanie białek - pozostawanie białek w formie natywnej w obecności konkretnej ilości soli
10. Dobór odpowiedniego buforu (pH, czynniki stabilizujące - substancje redukujące np. Beta - merkaptoetanol, cysteina, DTT, glutation - przeciwdziałają utlenieniu grup -SH w białkach)
11. Inhibitory peptydaz (enzymów proteolitycznych)
12. Niska temperatura (4 st)
13. Przechowywanie - odpowiednie warunki
Kontrola po każdym etapie:
14. Stężenie białka (metody fotometryczne)
15. Aktywność enzymu
16. Liczbę białek w preparacie (elektroforeza analityczna)
Zapobieganie proteolizie oczyszczanych enzymów
17. utrzymywanie odpowiednio niskiej temperatury
18. Obecność inhibitorów peptydaz
19. W niektórych przypadkach - ultrafiltracja z limitem odcięcia <30kDa
Inhibitory peptydaz:
Fluorek fenylometylosulfonylu - inhibitor peptydaz serynowych i cysteinowych
Pepstatyna A
E-64 - inhibitor wyłącznie peptydaz cysteinowych
EDTA - inhibitor metalopeptydaz
Dezintegracja komórek - problemy:
20. Komórki zwierzęce : brak ściany, duże rozmiary - jest fajnie
21. Komórki zwierzęce : ściana komórkowa (skrobia, celuloza, barwniki), duże rozmiary
22. Bakterie : sztywna ściana komórkowa, błona zewnętrzna u Gram ujemnych, niewielkie rozmiary, komórki sferyczne
23. Grzyby : bardzo sztywna ściana (chityna/glikan), aktywne enzymy proteolityczne
- problemy ogólne: utrata mechanizmów kontroli metabolizmumw momencie rozbicia komórek, efekty cieplne związane z zastosowaniem metod mechanicznych - tarcie = ciepełko
Homogenizacja materiału badawczego
Metody mechaniczne : moździerz - piasek, ciekły azot, homogenizator ręczny lub elektryczny, vortex - kulki szklane
Metody fizyczne: sonikacja (działanie ultradźwięków), prasa Frencha (wysokie ciśnienie) - fajne drogie urządzenie z tłokiem, którego naciśnięcie powoduje wzrost ciśnienia w komorze, co za tym idzie w komórkach - potem następuje nagły spadek ciśnienia, dochodzi do rozerwania błon plazmatycznych
Inne metody fizyczne : szok osmotyczny, szok termiczny
Inne metody (enzymatyczne) : bakterie : lizozym+DNAza dla G+, lizozym+DNAza +EDTA, detergent niejonowy + lizozym dla G-
Grzyby : chitynaza + beta-glukanaza, Beta-glukuronidaza
Kom roślinne : celulaza
Wirowanie - sedymentacja cząstek pod wpływem siły odśrodkowej
Wstępne oczyszczanie ( metody o niskiej selektywności)
- rozpuszczalność białek w roztworach wpdnych wynika z obecności na ich powierzchni polarnych i zjonizowanych łańcuchów bocznych aminokwasów
- każdy czynnik zaburzający interakcję woda-białko zmniejsza tę rozpuszczalność
- rozpuszczalność białka wynika z różnic w składzie aminokwasowycm
Czynniki powodujące precypitację białek:
24. Sole nieorganiczne (siarczan amonu) - wysalanie
25. Rozpuszczalniki organiczne (aceton, metanol, etanol -20 st) - osuszenie
26. Glikol polietylenowy (polimer niejonowy)
27. pH (np. wykwaszanie białek o niskim pI, węglan sodu > pH 8)
28. Temperatura (białka termolabilne) - bardzo termostabilne enzymy - polimerazy
- możliwie krótka ekspozycja na działanie czynnika
- możliwie niska temperatura (2-4 st)
Wytrącanie białek poprzez zmianę pH:
-rozpuszczalność białek zależy od pH roztworu
-rozpuszczalność danego białka jest najmniejsza przy pH = pI
Np. Iminona peptydaza prolinowa z kiełkującyh ziarniaków zbóż
Frakcjonowanie rozpuszczalnikami organicznymi:
-białka wytrącane są w wyniku dodania do roztworu mieszających się z wodą, niedenaturujących rozpuszczalników organicznych
-najczęściej stosowane: aceton, etanol
Wysalanie białek :
-białka ulegają odwodnieniu i wypdają z roztworu w wyniku zwiększenia jego siły jonowej po dodaniu soli (siarczan amonu, siarczan sodu)
Zagęszczanie roztworów białek -później rozc preparatu białkowego podczas rozdziału chromatograficznego
29. Dodanie ziaren suchego, porowatego polimeru (sephadex G25) wielkość porów musi być tak dobrqna, aby nie wnikały w nie cząsteczki białek
30. Usunięcie nadmiaru wody oraz niewielkich cząsteczek przez dyfuzję poprzez półprzepuszczalną membranę (ultrafiltracja)
materiały używane do otrzymywania błon półprzepuszczalnych:
- octan celulozy
- poliwęglan
-poliamidy
- PCW
- polisulfon
31. Usunięcie wody pod zmniejszonym ciśnieniem (liofilizacja)
Chromatografia cieczowa (selektywna metoda rozdziału mieszanin)
32. Metoda fizykochemiczna
33. Podział składników między dwie fazy (stacjonarną i ruchomą)- faza ruchoma jest cieczą, faza stacjonarna jest ciałem stałym
34. Najefektywniejsza z metod oczyszczania białek
35. Różne tempo przemieszczania się składników mieszaniny wynika z ich różnego powinowactwa do fazy stacjonarnej
a. Chromatografia sita molekularnego - kształt i wielkość cząsteczek
b. Chromatografia jonowymienna - wypadkowy ładunek cząsteczek
- rodzaje złóż: anionity (wymieniają aniony), kationity (wymieniają kationy)
- silne S, słabe W
- anionity : DEAE, QAE
- kationity: CM, SP, S
- jeżeli pH>pI używamy anionitu
- jeżeli pH<pI używamy kationitu
36. Dobór rodzaju złoża
37. Dostosowanie rodzaju buforu do rodzaju złoża (dla a, bufory k; dla k, bufory a)
38. Naniesienie próbki w roztworze o niskiej sile jonowej, nie więcej niż 50 milimoli
39. Eluacja - wzrastający gradientem soli, gradiengem pH, gradientem amfolitu (chromatoogniskowanie)
+ zagęszczenie próbki, brak ograniczeń objętości próbki nanoszonej na kolumnę, łagodne warunki nanoszenia i elucji, wysoka rozdzielczość
- bezwględma konieczność zachowania niskiej siły jonowej próbki, białka eluowane z kolumny roztworem o wywokiej sile jonowej
a. Chromatografia adsorbcyjna - polarność
b. Chromatografia powinowactwa - powinowactwo do ligandu
Techniki chromatograficzne:
40. Formulacja nośnika:
i. Bibułowa (nośnik w bibule)
ii. Cienkowarstwowa
iii. Kolumnowa (nośnik w kolumnie chromatograficznej)
41. Różnice w ciśnieniach przepompowania fazy ruchomejmprzez stacjonarną
i. LPLC - niskociśnieniowa chromatografia cieczowa
ii. FPLC - szybka chromatografia cieczowa
iii. HPLC - wysokociśnieniowa wysokosprawnościowa chromatografia cieczowa
---różnią się rodzajem złóż i przyłożonym ciśnieniem, zasada rozdziału pozosttaje taka sama
xkathyx249