BKR 2014-12-09
Badanie eksperecji genów
in situ; RT
detekcja głównie w cytoplazmie
metody lokalizacji ekspresji w komórkach
* klasyczne metody izolacji a D/R NA dezintegracja
* metody in situ na żywych lub utrwalonych tkankach
niezmieniona struktura
hybrydyzacja – łączenie komplementarnych nici ds D/R NA do ss
denaturacja
renaturacja D/R NA
czynniki:
* temperatura powoli do 90* - 100*C więc ds->ss; obniżenie do 65*-75*C ss-> ds
* pH. Forma enolowa w środowsku alkalicznym zasady azatowe występują – atom O w formie O- destablilizacja wiązan wodorowych Normalnie w komórce obojętne lub lekko kwaśne
* substancje mocznik foramid rozrywają wiązania H między diploami wody co zmienia energetyczną stabliność II rzędowej struktury DNA
hybrydy
RNA-RNA najstablilniejsze
RNA-DNA
DNA-DNA najstablilniejsze
Procedura lokalizacji in situ
utrwalanie materiału
cele
zachować kwasy
zachować morfologię
dostępność dla sondy
poziom mRNA ulega szybkiemu spadkowi i ulega degradacji
utrwalacze
kwas octowy i etanol
+ dobra dostępność docelowych cząstek dla sondy
- strady RNA
- słabe zachowanie struktury tk
glutar-aldehyd
+ zachowuje RNA w tkance
+ zapewnie zachowanie morfologi
- silnie więże białka ni bloku wnikanie sądy
parformaldehyd
+ zapewnia nalepszą czułosć (nie powoduje strat R/D NA
+ dobrą dostępność dla sondy
- słabsze zachowanie struktury próbki
substancje do zatopienia
parafina
Długotrfała procedura
wysoka temeratura 50-60*C
żywice akrylowe
na zimno 1*C
twardsze => cieńsze skrawki
hybrydyzacja in situ
łączenie z sądą
płukanie – eleminacja tła
detekcja sygnału
bezpośrednio – hybrydy widoczne pod mikroskopem bo fluorochrom połączony do sądy
pośrednio – immunocytochemiczne procedury
matryca cząstka mRNA w cytoplazmie
sonda – cząstka RNA lub DNA syntetyzowana in vitro na bazie sekwencji matrycy Do cześci UTP trifosforan urydyny sodny połączony marker
radioaktywny 32S 3H
digoksygenina DIG, biotyna lub Alexa Fluor
sonad 150-600 bp
umozliwia wykrycie sekwencji R/D NA umożliwia wykrycie hybryd bo ma markery
synteza sondy RNA
przy uzyciu polimareazy RNA zależnych od DNA polimerazy SP6 T3 T7
kłopoto z matrycą DNA
wizolować nRNA
przypisać sekwencję nRNA na cDNA (odwrotna transkrypcja
wyklonować cDNA w wektor plazmid zawierający 2 miejsca specyficzne inicjaci transkrypcji dla wybranych polimeraz RNA
namnożyć DNA
pociąć enzymamy restrykcyjnymi
wizolować fragment zawierajacy wkloownie cDNA wraz ze specyficznymi miejscami incjaci transkrypcji dla SP6 t3 lub t7
na bazie wizolowanego fragmetnu zyntetyzować sondę rna znakowwaną markerem w kierunku antysensi przy pomocy ppolimerazi sp6 do hybrydyzacji z m RNA obecnym w preparazi i oddzielnie w kierunku sens przy pomcoy polimerazy t7 do kontroli hybrydyzacji
przeprowadzić alkalziczną dybrydazcję obu sond aby otrzymać 300-400 nukleotydów
dynteza sądy dna
polimeraza DNA w rekacji PCR
procedura
przepisać sekwencję mRNA na cDNA
amplifikować cDNA w PCR przy uzyciu starterów które dają 300-400 bp
na bazie produtku PCR zsyntetyozwać przez asymetryczney PCR sondę DNA znakowaną markerem w kierunku antysens przy pomory staretera reverse 3' – 5' i oddzielenie w kierunku sens przy pomocy primera forward 5'-3' do kontroli hybrydyzacj
rodzaje sond
ds cDNA
ss cDNA (o sekwencji identycznej z docelową cząsteczką kwasu nukleinowego i antysensoweo
ssRNA sensowwna i antysensowna
syntetyczne oligonukleotydy
sondy RNA
+nie trzeba denaturować
+nie renaturują niędzy sobą
+ stabline
+ niezhybrydyzowane cząsteczki RNA mogą sostać strwione przez RNazy
RNazy
rnazy
- trudniejsze do sytenzy
- mogą łączyć się nispecyficznie => silne tło mniej sąd do wnętrza komórki
sondy sscDNA
+ nie trzeba denaturować
+ nie reneturują
- trudniejsze do syntezy
- mniej stablilne
sondy dsDNA
+ łatwa w uzyciu nie wymaga subklnowania
+ duzy wybór znaczników
+duża wydajność znakowania
- wymaga denaturacji
- obniżona czułość bo następuje renaturacja
oligonukleotydy
+ nie wymagają zastosowania technik biologi molekularnej
stabline
wnikają do wnętrza tkanek
nie hybrydyzują
- ograniczony wybór znaczników
mała efektyczność znakowania
mała ilość znaczników wybodwana wewnątrz sądy
mnej stabline
wymagają dostępu do aparatury
znaczniki
do znakowania dUTP
cząsteczka znacznika przyłącza się do C5 urydny
radioaktywne
3H 32P 35S 14C 125I
nieradioatkwyne
biotyna
dioksygenina
fluorochormy
+łatwość znakowania
+ czułe
-długi czas dtekcji
radioizotypy niestabilne
-bezpieczeństwo i utylizacja
sądy znakowane biotyną
+wiele możliwości detekcji pośrednie
+ przeciwciała
+awiadyna streptomycna (białka silnie wiążące się z biotyną kowalecyjnie związane z fluorchomami ferrytyna złotem kolidalnymi enzymalmi alkaliczną fosfadazą peroksydazą
- w niektóych tk występuje endogennie
digosygenina DIG
steroid występujący wyłącznie Digitalis purpurea Digitalis lantata
kwiaty i liście obu roślin są jedynym naturalnym źródłem – przeciwciała anty DIG nie powinny łączyć się z innym materiałem biologicznym
DIG-dUTP może byłać włączana do kwasów nukleinowych w reakcjach enzy przez DNA polimerazy RNA polimerazy terminalną transferazę
sądy wyznakowane dig są wykrywalna za pomocą przeciwciał – pośrednio
sądy znakowane fluorochromami
+ mogą być przyłączna chem lub enz
9 wysoka rozdzielczość
możliwość wielu kolorów naraz
detekcja bezpośrednia
zielone
fluoresceina
izotiocyjanian fluoresceiny
czerwone
rodamiina
izotiocyjanian tetrametyloordaminy
niebieski octan aminomeylokumaryny
hybrydyzacaj in situ z sądą
bufor hybrydyzacjny + znakowana nonosie na szkiełko podstawowe szczelnie szkiełkiem nakrywkowym specjalne ramki lub lakier do paznokci inkubacja 45*C
noc
odpłukuje się sądę niezwiązaną z docelową czaśtką lub niespecyficzne – eliminacja tła
parametry wpływające na stablinosć hybryd
temp - im wyższa tym bardziej specyficznie
pH im niższe
koncentracja katoionów (np. Na+ im niejsze stężenie
rozpzpuszczalniki org formaldehyd im wyższe stezenei
w temp niższej o 16-32*C od temperatury topnienia sądy (czyli odzielania od RNA)
Na+ stablizują dwuniciową strukturę
im wyższe w zakresie 0,01-0,2M tym stablilniejsze hybryd
wyższe nie wplywa
formanid oniża temp to dodatek 1% oniża o 0,72*C
więc można w 30-40*C
płukanie pohybrydyzacjyne
zbyt silne
wzrost specyficzności
spadek czułości
zbyt łagodne
oniżenie spefycinicznoe
duże tło
niska czułość
przy najczulszych, radioaktywncyh musi być ponad 20 kopi na komórkę
grupsze skrawki – gorsza rozdzielczosć
metoda RT-PCR
odwrotna transkrypcja synteza cDNA na matrycy mRNA
polimeraza DNA zależna od RNA
odwrotna transkryptaza AMV MMLV i składa się z jednego cyklu 37*C
Podany w reakcji odwrotnej transkrypcji cDNA j
RT-PCR bezpośredio
pośrednio – bez nakowanych nukleotydów
zastosowanie
możemy wykorzystywać występujące w małej ilości
mogą powstawać pozytwynie fałszywe wyniki
etapy
odwrotna transkrypcja
rekcja pcra
oprócz standardowych nukeotydów
dATP cCTP dGTP dTTip dTTP dUTP-DIG
powstawanie wyników fałszywie pozytywnych dlatego lepiej stosować startey specyficzne ale mimo to mogą być amplifikowane genomowe DNA
startery rozcięte przez intron
nie za krótke 25pz
należy unikać fragmetnów zawierających powtó¶zenia dTTP
bezpośredni
marker optycznie czynny
zdarza się wynik fałszywie pozytwny
pośredni
dłuższa
wysoce specyficzna wyższa czułość
używa się przeciwciał
in situ rt pcr i hybrydyzacja
odwrotna transkypcja
pcr in situ
płukanie w buforach
synteaz dwuniciowej wej sondy DNA
dtekcja
zwiększenie ilości cdna namnożenego w wynku reacji in situ odwrotnej transkrypcji i pcr dostępnego do tekcji znakowaną sondą
brak tła spowodowengeo detekcją genomoeg DNA i niespecyficznych starterów
-czasochłonna i dwuetapo
detekcja
bezpośrednie
fluorochorm
pośrednie biotyna
cytochmiczne biotyna-streptawidyna-peroksydaza chrznowa
przeciwciała znaczniki mogą być sprzeżzone z
enzymami alkaliczną fosfatazą peroksydazą chrznaową
fluorchormami fluorocyssteiną rodaminą
złotem koloidalnym
wolne – niesprzężone
przeciwciała związane z enzyami – barwny produkt
alkaliczna fosfataza – bcip/npt do formazanu – niebieskofilotelowy na stałe
kontrole
sensowene lub będące fragemteanmi genów nie ulegających ekspresji
kilka sąd
RNazy przed hybrydyzacją
northre blot
kontrola pozytywna sondy komplementare do sekwencji nRNA genów ulegających eksperazji we wszystkich typach
jakie informacji o lokalizacji wapnia uzyksano w pracy
rudzińska lengald strutkura komórek endodermy korzenia Glodiona x hybridus van Houtte Acta soc bot pol volume 2002 71 (4); 275-282)
wrib.biologia