11.04.2012 – Wykład 9
TEMAT: Apoptoza
Szczegółowo opracowana na ćwiczeniach.
Fizjologiczna śmierć komórki (śmierć zaprogramowana) synonim apoptoza.
Jest konsekwencją samobójczego programu genetycznego, uruchomianego w odpowiedzi na złożone oddziaływanie z innymi komórkami.
Najczesciej nastepuje naruszenie integralność 1 z 4 systemów wewnatrzkomórkowych:
- oddychania tlenowego
- funkcjonowania błon komórkowych
- enzymów białek strukturalnych
- naprawy aparatu genetycznego
apoptoza Caenorhabiditis elegans
dorosły osobnik jest hermafrodytą i składa się z 959 komórek somatycznych. Liczba komórek powstających 1090. w wyniku apoptozy ginie 131
-113 umiera podczas embiogenezy
- 18 podczas dorosłego życia
Genetyczna kontrola apoptozy:
- „ced” geny śmierci są dobrze zachowane w procesie ewolucji
- ekspresja genów ced-3 i ced-4 odpowiada za molekularne procesy apoptozy
- ced-9 (u ludzi bcl-2) ekspresja w komórkach stymulowanych do proliferacji ( m. in. limfocyty prawidłowe, kom. nowotworowe)
Zdrowa komórka -> Komórka obkurcza się i oddziela od komórek sąsiednich -> Powstawanie pęcherzyków (uwypuklenie) kondensacja chromatyny i cytoplazmy -> Marginacja skondensowanej chromatyny -> Fragmentacja jądra i komórki ->Ciałka apoptotyczne -> Fagocytoza
Różnice morfologiczne pomiędzy apoptozą a martwicą:
Apoptoza:
1. Dotyczy zwsykle pojedynczych komórek
2. Zmniejszenie objętości komórki i pofałdowanie błony komórkowej
3. Kondensacja chromatyny, fragmentacja jądra
4. Zamknięcie organelli w ciałkach apoptotycznych
5. Ciągłość błony kom. zachowana aż do momentu sfagocytowania ciałek apoptotycznych
6. Brak zapalenia, hamowanie rekacji zapalnej
7. Fagocytoza przez sąsiednie komórki i makrofagi
Martwica:
1. Najczęściej dotyczy grup komórek
2. Zwiększenie objętości i pęcznienie komórki
3. Brak kondensacji chromatyny, liza jądra
4. Pęcznienie i rozpad organelli
5. Perforacja błona, zawartość komórek wydostaje się do przestrzeni pozakomórkowej
6. Odczyn zapalny ze strony otoczenia
7. Fagocytoza przez fagocyty.
Zmiany biochemiczne:
Materiał genetyczny:
- Apoptoza: aktywacja specyficznych endonukleaz, fragmentacja, utworzenie odcinków o długości 200-300 kb, 20-50 kb, 200-300 bp
- Martwica: Aktywacja niespecyficznych nukleaz, fragmentacja na odcinki o przypadkowej długości,
Rozdział elektroforetyczny DNA:
- Apoptoza: obraz drabinki DNA
- Martwica: obraz smugi (smear)
Aktywacja enzymów:
- Apoptoza: kinaz białkowych (np. kinazy MAP) i fosfataz, nukleaz, kaspaz, kalpain
- Martwica: niespecyficzna degradacja
Czynniki wywołujące apoptozę:
- hormony i cytokiny
- deficyt czynników wzrostowych i troficznych
- czynniki cytotoksyczne
- czynniki fizyczne
Szlaki sygnałowe apoptozy
W zależności od rodzaju komórki i czynnika indukującego proces apoptozy może przebiegać różnymi ścieżkami.
Do najlepiej poznanych należą:
- szlak związany z błoną komórkową tzw. zewnętrzny,
- szlak wewnętrzny zwany mitochondrialnym,
- szlak angażujący perforyny i granzym B, czyli pseudoreceptorowy,
Apoptoza może również odbywać się z udziałem szlaku sfingomielinowo-ceramidowego oraz indukowanego stresem.
Szlak zewnętrzny:
- pobudzenie receptorów śmierci należących do nadrodziny receptorów TNF np. Fas/CD95/Apo1/TRAIL-R1 i R2/Apo2
- receptory śmierci posiadają wewnątrzkomórkową domenę śmierci DD,
- po związaniu się odpowiedniego ligandu z receptorem błonowym (TNF-alfa, FasL, TRAIL/Apo2l) dochodzi do oligomeryzacji receptora, a następnie powstaje kompleks DISC (
- kompleks ten powstaje poprzez połączenie domen śmierci z białkiem adaptorowym FADD oraz z prokaspazą 8,
- następuje aktywacja prokaspazy 8, która jest bezpośrednim aktywatorem kaspazy 3 (kaspazy wykonawczej),
Szlak wewnętrzny:
inicjowany jest poprzez:
- zmiany potencjału mitochondrialnego
- mutacje DNA
- inne zaburzenia metabolizmu komórkowego
Szlak ten może łączyć się ze ścieżką receptorową zewnętrzną poprzez białko Bid, które ulega proteolizie – powstaje tBid (truncated Bid) – postać ta wpływa na uwalnianie cytochromu c – aktywacja szlaku mitochondrialnego.
- istotnym etapem jest uwolnienie cytochromu c z przestrzeni międzybłonowej poprzez specjalne kanały,
- kanały te tworzenie są poprzez białka z rodziny Bcl-2 (bax, bak) z białkiem VDAC (Voltage Dependent Anion Channel
- przez kanały z mitochondrium do cytoplazmy dostaje się cytochrom c
- wpływ cytochromu c jest sygnałem do tworzenia kompleksu zwanego apoptosomem,
- apoptosom składa się z cytochromu c, prokaspaza 9, białka Apaf-1(ATP),
- kompleks ten potrzebny jest do autoproteolizy kaspazy 9, która następnie aktywuje kaspazę 3,
- podczas apoptozy z mitochondrium uwalniane są także białka Smac/Diablo i Oni/HTR A2 są one antagonistami inhibitorów apoptozy (IAP)
Szlak pseudoreceptorowy – indukowany przez cytotoksyczne limfocyty T oraz komórki NK,
- limfocyt w kontakcie z komórką docelową uwalnia perforyny,
- cząsteczki perforyny tworzą w błonie komórki docelowej kanały
- przez kanały wnikają granzymy B do komórki docelowej aktywujące szlak kaspaz,
- wraz z granzymami uwalniają się jony Ca2+ wpływające stymulująco na proces apoptozy
Właściwości kaspaz:
- proteazy cysteinowe, substraty ich zawierają kwas asparaginowy w pozycji P1 (proteoliza w miejscu reszty Asp)
- syntetyzowane są jako nieaktywne zymogeny
- dotychczas zidentyfikowano 14 kaspaz: kaspazy inicjatorowe -8, -9 również -2, -10; kaspazy wykonawcze -3, -6, -7
- kaspazy inicjatorowe posiadają „domeny śmierci” CARD i DED
- kaspazy wykonawcze aktywują enzymy prowadzące do destrukcji komórek
Białka trawione przez kaspazy:
- większość tych białek uczestniczy w procesach molekularnych związanych z cyklem komórkowym i apoptozą.
- do proteolizy białek dochodzi tylko przy udziale kaspaz -3, -6, -7,
Trawione są miedzy innymi białka:
- Białko PARP – bierze udział w rozpoznaniu i naprawie DNA
- białko ICAD
- białko Rb – kontroluje przechodzenie komórki przez kolejne fazy cyklu komórkowego
- białko MDM2 – wiąże się z białkiem p53 i je stabilizuje
- niektóre białka szkieletu komórki np. laminy, aktyna, fodryna,
- inne cząsteczki kaspaz
Śmierć komórki niezależna od kaspaz:
- proteaza aktywowana wapniem kalpaina, pełni autonomiczną rolę w apoptozie,
- ostatnie doniesienia wskazują na jej role w procesie aktywacji i unieczynnienia kaspazy-3, -7, -9 i ostatnio -12,
Proteazy serynowe: jedna z nich AP24 zaangażowana jest we fragmentację DNA,
- Katepsyna D, proteaza lizosomalna, zaangażowana w zewnątrzpochodną drogę aktywacji apoptozy,
- Także inne katepsyny mogą uczestniczyć w regulacji apoptozy,
Rodzina białek Bcl-2: białka proapoptotyczne ( Bax, Bad, Bak, Bik. Bid, Bcl-xs) zmuszają komórkę do apoptozy; antyapoptotyczna (Bcl-2, Bcl-x1, MCL-1) zwiększają prawdopodobieństwo przeżycia komórki
- pełnią funkcję regulatorów apoptozy przez oddziaływanie na wiele istotnych procesów komórkowych, jak:
- kontrola komórkowego poziomu jonów (Ca2+, H+, K+, Cl-) – tw3orza konały wbudowywane między innymi w błony mitochondrialne
- nadzór nad stanem redoks
- regulacja wypływu z mitochondriów cytochromu c i AIF
- aktywacja enzymów kaspaz i DN-az
Rodzina białek Bcl-2
-Tworza homo i heterodimery:
- stosunek homodimerów antyapoptotycznych do proapoptotycznych decyduje o śmierci bądź przeżyciu komórki
- połączenie się białek w heterodimery o przeciwnstawnym charakterze powoduje inhibicję biologicznej ich aktywności
Fizjologiczne znaczenie apoptozy:
- apoptoza jest procesem i przeciwstawnym do mitozy i wspólnie z nią decyduje o liczbie komórek w każdej populacji
- ma ogromne znaczenie w embriogenezie, wzroście i rozwoju
Przykłady apoptozy w rozwoju kręgowców:
- śmierć komórek ogona kijanki w procesie metamorfozy,
- śmierć blisko połowy neuronów powstających w trakcie embriogenezy w rozwoju układu nerwowego,
- śmierć komorek soczewki oka w czasie jej kształtowania
- zanik błony pławnej między palcami u zarodka ludzkiego
- w życiu postnatalnym: apoptoza keratynocytów skóry, krypt jelitowych,
Apoptoza w stanach patologicznych
Ograniczenie apoptozy prowadzi do powstania:
- nowotworów,
- autoagresji komórek układu odpornościowgo,
Wzrost apoptozy jest charakterystyczny dla chorób zwyrodnieniowych: choroby Alzhaimera, Parkinsona, AIDS, zwału sercu czy udaru mózgu.
4
que-hiciste