Raport 7.docx

Patryk Konarski                                                                                                                                  03.01.2012 r.

Ćwiczenie 7.

ENZYMY. KINETYKA REAKCJI ENZYMATYCZNYCH.

I. Cel ćwiczenia.

1. Wyznaczenie optimum pH dla reakcji katalizowanej przez kwaśną fosfatazę.

2. Wyznaczenie szybkości początkowej reakcji katalizowanej przez kwaśną fosfatazę.

II. Opracowanie wyników.

1. Wyznaczenie optimum pH dla reakcji katalizowanej przez kwaśną fosfatazę.

Do probówek napipetowałem po 0,25 ml 8mM p-nitrofenylofosforanu i 0,25 ml odpowiedniego buforu, kolejno od pH 4,0 do 6,5. Wymieszałem zawartość probówek i wstawiłem je do łaźni wodnej o temp. 300°C. Wyciąg z ziemniaka zawierający kwaśną fosfatazę rozcieńczyłem w cylinderku miarowym na 25 ml 250x używając 0,9% roztworu NaCl. Następnie, do ogrzanych w łaźni wodnej prób, dodawałem w odstępach co 30 sekund po 0,5 ml rozcieńczonego roztworu enzymu. Próby inkubowałem 15 minut w temperaturze 300°C, po czym reakcję przerwałem dodając do każdej z nich, znowu w odstępach co 30 sekund i w kolejności takiej jak dodawano enzym, po 5 ml 0,1M roztworu NaOH.

Próbę zerową wykonałem postępując następująco:

do probówki napipetowałem 0,25 ml buforu o pH 5,0 oraz 0,25 ml roztworu p-nitrofenylofosforanu.

Mieszaninę inkubowałem 15 minut w łaźni wodnej razem z próbami badanymi, po czym dodałem 5 ml 0,1M roztworu NaOH, a na końcu dodałem 0,5 ml enzymu.

Natężenie barwy zmierzyłem wobec próby zerowej przy λ = 405 nm.

2. Wyznaczenie szybkości początkowej reakcji katalizowanej przez kwaśną fosfatazę.

Do suchych probówek napipetowałem po 0,25 ml buforu octanowego o pH  5,5 i 0,25 ml roztworu substratu. Każda próba zawiera zatem po 0,5 ml mieszaniny inkubacyjnej o pH optymalnym dla fosfatazy kwaśnej. Próby wstawiłem do łaźni wodnej o temperaturze 300°C. Reakcję enzymatyczną rozpocząłem dodając do każdej próby, w odstępach co 30 sekund, po 0,5 ml ekstraktu ziemniaczanego o rozcieńczeniu 10x. Próby inkubowałem: 2, 4, 6, 8, 10 i 12 minut. Reakcję przerwałem dodając, znowu w 30 sekundowych odstępach, po 5 ml 0,1M roztworu NaOH w kolejności takiej jak dodawałem enzym.                                                                                                                               Próby zerowe przygotowałem następująco:                                                                                                                           do probówki napipetowałem 0,25 ml buforu o pH 5,5 oraz 0,25 ml p-nitrofenylofosforanu. Mieszaninę inkubowałem 12 minut w łaźni wodnej razem z próbami badanymi, po czym dodałem 5 ml 0,1M roztworu NaOH i na koniec 0,5 ml enzymu o rozcieńczeniu 10x.                                                    Dokonałem pomiaru absorbancji przy λ = 405 nm wobec próby zerowej.

pH 5,5

III. Wnioski.

Rozcieńczenie enzymu ma wpływ na aborbancję badanych substancji. Im wyższe stężenie enzymu tym wyższa absorbancja. Absorbancja rośnie również w raz z czasem działania enzymu na daną substancję, co wynika z powyższego doświadczenia. Okazało się także, że działanie kwaśnej fosfatazy ma swoje optimum w pH około 5,5.