Streszczenie 57-69.doc

TWÓJ BIOTECHNOLOG https://www.facebook.com/twoj.biotechnolog

STRONY 57-69

Separacja cząsteczek przez elektroforezę

Elektroforeza, tak jak chromatografia jonowymienna jest techniką rozdziału, które wykorzystuje różnice w ładunkach elektrycznych, aby rozdzielić cząstki w mieszaninie. DNA ma ładunek ujemny i dlatego wędruje zawsze w kierunku dodatniego pola. Tempo migracji molekuł DNA zależy od ich kształtu i stosunku ładunek/masa, niestety większość cząsteczek DNA ma oba te parametry bardzo podobne i standardowa elektroforeza okazuje się być bezużyteczna. Rozwiązaniem jest wprowadzenie żelu elektroforetycznego, który jest zrobiony z agarozy lub poliakrylamidu i składa się z sieci porów. Przez nie przeciska się DNA, im mniejsza cząsteczka DNA tym szybciej przeciska się przez żel. Elektroforeza w ten sposób rozdziela DNA w zależności od jego rozmiaru, a zatem długości nukleotydowej.

Kompozycja żelu determinuje czułość metody. Jeśli użyjemy 0,5 % agarozy uwidoczni ona cząstki o długości 1-30 kb, ponieważ ma dość szerokie pory. Jeśli potrzebujemy czulszego medium użyjemy 40% żel poliakrylamidowy, który rozdziela cząstki w zakresie 1-300 par zasad, czyli jest w stanie rozróżnić poprzez swoje malutkie pory, cząstki DNA różniące się zaledwie 1 nukleotydem.

Wizulaizacja DNA w żelu agarozowym

Najprostszym spsobem jest uzycie substancji która czyni DNA wiodcznym i najlepiej nadaje się do tego EtBr. Po naswietleniu UV DNA które powiazano z EtBr, widoczne są paski. EtBr ma jednak swojem inusy, jest ot silny mutagen, który w dodoatku niep pokaze poprawnie pasku jeśli materal genetyczny nie przekracza 10 ng. Daltego używane są różnokolorwoe, niemutagenne barwniki, które barwią DNA na zielono, niebiesko, czerwono. Mogąś być oner dodawnae już na etpaie samego początku, ich plusem jest również to że niep otrzeba uzywac lampy UV, ktoram oze psalic próbki, lecz innych dlugosci fali, które są mniej szkodliwe, są onerównież w stanie pokazac nawet 1 ng DNA.

Wizualizacja przez EtBr:

Okreslenie wielkosci cząsteczek, na podstaiwe obrazu elektroforetycznego.

Im mniejsza czastka tym szybciej migruje ona w żelu, jeśli jest ich wiele, w obrazie widizmy serie pasków, jak orzypisac im konkretną długość?

Najlepszą metodą jest matematyczne powiazanie tempa migracji z masą cząsteczkową danego fragmentu DNA.

D= (a-b)log M

D- dystans przebyty

M- masa cząsteczkowa

a i b – stałe zależne od warunków eksperymentu

Poniwaz nie jest wymagan jakas ekstremalna dokladnosc, często zamiast formuł matematycznych używa się fragmentów o znanej wielkosci, które są dodawane do zelu elektroforetycznego, i nazywane są markerem. Na przykład HindIII tnie DNA faga λ, na 8 fragmentów o znanych masach od 125 bp do 23 kb. Jelsi znamy wielksoc tych fragmentów, możemy przpyorzadkowac naszej badanej próbce odpowiednie wielkosci poprzez porównanie polozenia pasków w dwóch sciezkach na płytce. Cześto używa się mieszaniny zwanej drabinką DNA, która zaiera szereg fragmentów o znaej długości od 100 bp do 1kb. Chociaz takie porównanie na oko, nie jest zbyt dokaldne, wielkosc błedu nie przekracza zazwyczaj 5% co satysfakcjonuje badaczy.

Przykład takiego porównania(a) i wykresu matematycznego(b):

Mapowanie pozycji restrykcyjnych w czasteczce DNA

Skoro już znamy ilość i wielkosc fragmentów DNA, pora przystapic od anlizy restrykcyjnej, która pokaze nam mapę miejsc restrykcyjnych dla roznych enzymów w czasteczce DNA. Tylko jelsi mapa restrykcyjna jest kompletna i poprawan, dana caastka DNA może być uzyta do manipulacji z obcym materialem genetycznym. Aby taka mapę skonstruować, potrzeba serii eksperymentów z trawieniem. Najpierw porownujemy wynik pierwsze go trawienia z markerami, a potem wykonujemy drugie trawienie inną restryktazą. Możliwe jest czasmai wykoanie dwóch trawień naraz, jeśli oba enzymy wymagają podobnych warunków, bądź jedno zaraz po drugim jelsi oba enzymy róznią się wymaganiami. Watpliowsci ktorep owstana po tkaim podwojnym trawieniu co od pojedynczych miejsc restrykcyjnych rozwiazuje się za pomocą trawienie cześciowego., które polega na tym że zmienia ise warunki dla jednego z enzymów tka aby przecial on tylko czesc cząsteczek, uzyskuje isę to porzez zmiane temperatury która ogranicza aktywbność enzymu. Rezultatem trawienai czesciowego jest wzór pasków na płytce. Poza pasakmi które się powtorza ze standardowego trawienia, pojawią się również inne które są złoznoe z dwuch przyległych fragmentów restrykcyjnych, które nie zostąły przecięte, gdyż enzym nie dosiegnął miejsca restrykcyjnego , które się w nich znajduje. Ich wielkosc pozwala ustalic które z miejsc restrykcyjnych nastepują po sobie w oryginalnej cząsteczce DNA.

Zastosowanie mapy restrykcyjnej:

Wykonywanie trawienia częściowego i analiza danych do budowy mapy restrykcyjnej:

Elektroforeza dla rozdzielania dużych cząsteczek

Opisane wyżej metody  i formuły są skuteczne dla rozdziału małych cząsteczek DNA, badania empiryczne dowiodły jednak że cząstki większe niż 50 kb, nie są skutecznie rozdzielane i aparat matematyczny do pomiaru ich wielkości również zawodzi.

Limitacja wielkością nie jest problemem dla cząsteczek DNA, które są cięte przez enzym które rozpoznają cztero lub sześciu nukleotydowe sekwencje, gdyż produkowane przez nie fragmenty zazwyczaj nie przekraczają 30 kb. Problemy pojawiają się gdy musimy użyć enzymu takiego jak NotI, który tnie sekwencje 8-nukleotydowe., co oznacza ze pocięte przez niego fragmenty mają średnio 48=  65 536 bp = 65,5 kb, czyli są za długie od rozdziału tradycyjna elektroforezą żelową. Te ograniczenie może być usunięte jeśli użyjemy bardziej kompleksowego pola elektrycznego. W ten sposób wymyślno technikę elektroforezy żelowej z polem wielokierunkowym(ortogonalnym) w skrócie OFAGE. Zamiast aplikacji pola wzdłuż żelu tak jak do tej pory, wymyślono, aby elektrody były w rogach płytki po jednej w każdym, i skierowane pod katem 45 st. w kierunku żelu. Powstaje wówczas pole pulsacyjne, każdy impuls takiego pola wymusza dodatkowy obrót cząsteczek DNA o 90 st., po którym dalej wędrują one po linii prostej. Kluczowe jest to że cząstki mniejsze wykonują ten obrót szybciej, przez co skala rozdziału pozostaje wciąż dokładna. Ten dodatkowy wymiar pola zwiększa zdolność rozdzielcza żelu dość dramatycznie, tak że cząsteczki do kilku tysięcy kilo par zasad długości mogą być rozdzielone.

Zależność wielkości cząsteczek od pokonanego przez nie dystansu:

OFAGE:

Wielkość cząstek jest ważna także w przypadku chromosomów wziętych z drożdży, grzybów  czy zarodźców malarii. I tu zawodzi standardowa elektroforeza, wiec aby rozdzielić te cząstki od siebie używane jest również OFAGE, jak i bliźniacze do niego techniki jak zaciśnięte w kontur homogeniczne pole elektryczne (CHEF) i odwrócenie pola elektroforezy żelowej (FIGE).

4.3 Ligacja

Ostatnim krokiem jest doprowadzenie do polaczenia ze sobą przeciętego wektora i insertu. Taki proces nazywamy ligacją. Wszystkie żywe komórki produkują ligazy, lecz te używane w laboratorium pochodzą z faga T4. Rola tych enzymów sprowadza się łączenie nieciągłości zarówno w jednoniciowych jak i dwuniciowych cząsteczkach DNA, gdy brakuje w nich po prostu pojedynczego wiązania fosfodiestrowego. Nieciągłości mogą powstać w sposób zamierzony bądź być pozostałością replikacji lub rekombinacji. W tych procesach ligazy biorą aktywny udział. W rurce testowej ligazy są w stanie naprawić pojedynczą nieciągłość, jak i złączyć dwa końce DNA, w tym drugim przypadku muszą stworzyć po jednym nowym wiązaniu dla każdej nici, czyli w sumie 2 wiązania.

Działanie ligaz:

Ligacja lepkich i tępych końców

Ligacja tępych końców zachodzi rzadko i z małą efektywnością, a dzieję się tak dlatego że ligaza nie ma za co „złapać” cząsteczki DNA i musi liczyć na to wzajemną asocjację dwóch tępych końców. Aby przeprowadzić taką ligację należy użyć w mieszaninie dużego stężenia DNA. Dla porównania ligacja lepkich końców jest bardzo efektywna, ponieważ wystające końcówki fragmentów DNA wiaza się z ligaza zap pomocą wiązań wodorowych tworząc produkt przejściowy, w czasie którego ligaza może wykonać swoją pracę. Takie dłuzsze zetkniecie z ligazą powoduje że ligacja końców lepkich jest bardzo efektywna.

Ligacja tępych i lepkich końców:

Wprowadzanie lepkich końców do tępo zakończonych cząsteczek:

Jak już wiadomo występowanie lepkich końców jest pożądane. Cześto uzyskuje isę je przez potraktowanie tą sam restryktaza zaróno wektora jak i insertu. Często psotykana sytuacja sytuacja jest gdy wektor ma lepkie końcowe, ale nasz insert jest ich pozbawiony. Insert może nie mieć miejsc rozpoznawanych tą samą restryktazę co wektor i dlatego wymyślono 3 spsooby dodawania lepkich końców do fragentów tępo zakończonego DNA.

Linkery:

Są to krótkie dwuniciowe fragemnty , syntetyzowane chemicznie w próbowce, o znanej sekwencji. Typowy linker jest również tępo zakończony , lecz zawiera miejsce rozpoznawane przez odpowiednią restryktazę. Ligaza przyłącza linkery do tępych końców DNA, które są dalej tępę, lecz teraz mają miejsca rozpoznawane przez restryktazę, dodanie odpowiedniej restryktazy spowoduje ich czesciwoe strawienie i spowoduje ze będą to teraz lepkie końce. Aby uzyskać takie efekt trzeba dodać owych linkerów w nadmiarze. Wyprodukowane lepkie końce są teraz gotowe do wklonowywania.

Rysunek do tego:

Adaptory:

Problemem z użyciem linkerów jest to że dodanie restryktaz, może spowodować przeciecie insertu w połowie. Miejsce rozpoznawane przez restryktazy może bowiem znalezć się w środku cząsteczki, a nie tylko w samym linkerze. Wówczas uszkadzany jest sam insert, co pokazuje rysunek.

Daltego wprowadzone adaptory, które tym róznią się od linkerów że mają gotowe lepkie końce i niep otrzeba restryktaz do ich preparacji. Wydaje się to być prostym i skutecznym rozwiazniem, jednak i tu pojawia się problem, adaptory mogą bowiem ligować same ze sobą ponieważ są wyposazone w lepkie konce, przez co cząsteczka DNA, może mieć dalej tępę końce. Problem ten pokazuje rysunek:

Problem rozwaizano odpowednio modyfikujać końce 5’ adaptorów. Normalnie zawierały one grupę fosforanową która łączyła się naturlanie z 3’ końcem który zawierał grupę OH. Modyfikacja adaptorów polega na usunięciu grupy fosofranowej przy końcu 5’, przez co adaptroy mogą końcami 3’ łaczyć się z insretem, ale ich końce 5’ pozbaiowne grupy fosoforanowej, zapobiegaja ich wzajemnej ligacji, co zpaewnia pzoostawienie końców lepkich. Aby potem przywrócić normalność dla końców 5’ w dlaszych etapach eksperymentu, traktuje się je kinazą polinukleotydową, która dodaje na końcach 5’ z powrotem grupę fosforanową. Dzięki temu insert z takimi adaptorami „ulepszonymi” może się z ligować z wektorem.

Problem końców 5’ i 3’:

Użycie „ulepszonych” adaptorów:

Produkcja lepkich końców przez dodanie ogonów homopolimerowych:

Ogony homopolimerowe to inne podejscie do problemu dodawania lepkich końców. Homopolimer to po prostu polimer który skłąda się z tych samych podjednostek. Na przykład ciąg GGGGGGG nazywamy poli(dG), jeśli znajduję się na DNA, lub poli (G), jeśli na RNA. Reakcja ta jest przeprowadzana przez terminalną transferazę, która w obecności tylko jednego nukleotydu dodaje do końca 3’-OH, ogon homopolimerowy. Oczywiście, aby zligować taka cząsteczkę ogony na dwóch niicach musza być komplementarne to znaczy, jesli jeden jest poli (dC), to drugi musi być poli (dG). W praktyce oba ogony nie są tej samej długości, i połączona cząsteczka zawiera nieciągłości. Aby to naprawić używa się polimerazy Klenowa, która wypełni luki i ligazy, która dopełni szczelinę dodając ostatnie wiązania fosfodiestrowe. Ten proces nie zawsze musi być przeprowadzany w probówce, czasmai łancuch o długosci do 20 nukloetydów jest na tyle stabilny że można go wstrzyknąc do komórki, gdzie enzymy macierzyste gospodarza dokonają same stosownej naprawy.

Ogony hompolimerowe i ich zastosowanie: