Nowosad K, Stępień P, Musiał P - Sekwencjonowanie DNA. Przegląd metod [2015].pdf

(444 KB) Pobierz
Karol Nowosad
1
, Piotr Stępień
2
, Paula Musiał
3
Sekwencjonowanie DNA – przegląd metod
1. Wstęp
Terminem sekwencjonowanie określa się ogół metod prowadzących do
odczytania kolejności nukleotydów w cząsteczkach kwasów nukleinowych.
Pierwsze próby zsekwencjonowania DNA były podejmowane w latach 70
wraz z pojawieniem się metody chemicznej degradacji łańcucha DNA
i równoczesnym opracowaniem przez zespół Sangera metody terminacji
łańcucha. Przełomem w rozwoju metod sekwencjonowania było wyizo-
lowanie termostabilnej polimerazy z
Thermus aquaticus
oraz opracowanie
techniki PCR, co znacznie zwiększyło wydajność procesu sekwen-
cjonowania i skróciło czas analizy [1,2]. Wykorzystanie reakcji PCR ze
znakowanymi fluorescencyjnie nukleotydami oraz zastąpienie klasycznych
żeli poliakrylamidowych wykorzystywanych do rozdziału uzyskanych
fragmentów DNA nowoczesnymi kapilarami stosowanymi do rozdziału
umożliwiło zautomatyzowanie metody Sangera. Zautomatyzowane aparaty
do sekwencjonowania zostały wykorzystane do analizy genomów
większości organizmów modelowych oraz analizy genomu człowieka
w projekcie HGP (ang. Human Genome Project), który zakończył się w
2003 roku [3,4,5]. Opracowanie metod NGS (ang. Next Generation
Sequencing) na początku XXI wieku oraz rozwój w dziedzinie
bioinformatyki umożliwiło zwiększenie przepustowości analizowanych
danych, znaczne obniżenie kosztów oraz czasu prowadzonych badań [6].
Obecnie dostępnych jest wiele metod sekwencjonowania, jednakże
ograniczenia oraz ciągle wysokie koszty analizy przyczyniają się do
poszukiwania nowych rozwiązań umożliwiających opracowanie
alternatywnych technik określania sekwencji nukleotydów. W niniejszej
pracy przedstawiono charakterystykę najpopularniejszych metod
sekwencjonowania.
1
karol-nowosad@wp.pl, Uniwersytet Marii Curie-Skłodowskiej w Lublinie, Wydział Biologii
i Biotechnologii
2
piotr.stepien@interia.pl, Uniwersytet Marii Curie-Skłodowskiej w Lublinie, Wydział Biologii
i Biotechnologii
3
pp.auula17@gmail.com, Śląski Uniwersytet Medyczny w Katowicach, Wydział Nauk
o Zdrowiu, Katedra Fizjoterapii, Zakład Medycyny Sportowej i Fizjologii Wysiłku Fizycznego
141
Karol Nowosad, Piotr Stępień, Paula Musiał
2. Metody klasyczne
2.1. Metoda chemicznej degradacji DNA
Metoda sekwencjonowania DNA oparta o chemiczną degradację łańcucha
została opisana w 1977 roku przez dwóch naukowców Allana Maxama
i Waltera Gilberta. W technice tej, fragmenty DNA z odpowiednio
wyznakowanymi nukleotydami na końcach poddawane są przy użyciu
specyficznych związków chemicznych losowemu rozszczepieniu w pozycji
adeniny, guaniny, cytozyny oraz tyminy. Degradacja chemiczna oparta jest
na 3 etapach:
modyfikacji zasady azotowej;
usunięciu zmodyfikowanej zasady azotowej;
przecięciu nici DNA w miejscu apurynowym lub pirymidynowym.
Metoda prowadzi do otrzymania zbioru cząsteczek DNA zakończonych
określonym nukleotydem A, G, C lub T, różniących się długością
o 1 nukleotyd [7]. To co wyróżnia tą technikę od metody Sangera jest to że
w inny sposób uzyskuję się pulę tych cząsteczek. Materiałem wyjściowym
jest dsDNA (ang.
double-strand Deoxyribonucleic Acid),
które przed
rozpoczęciem degradacji chemicznej znakowane jest promieniotwórczą
grupą fosforanową na końcu 5` nici. Wyznakowane radioaktywnie
fragmenty DNA rozdziela się na 4 części umieszczając każdą do innej
probówki. Przy użyciu odczynników chemicznych prowadzi się reakcje
częściowego rozszczepienia w różnych częściach zasad. Przeprowadza się
zwykle cztery równoczesne reakcje dla A+G, G, C, C+T. W reakcjach
właściwych dla G oraz C związek chemiczny silniej oddziałuję na G niż A
oraz C zamiast T. Odczynnik chemiczny w reakcjach G+A i C+T działa na
pirymidyny i puryny z taką samą siłą. Ważnym detalem jest dodanie
związku chemicznego w bardzo niewielkiej ilości. Odpowiednie dobranie
warunków reakcji sprawia że tylko jedna zasada z danego fragmentu będzie
zmodyfikowana. Modyfikacja zasady prowadzi do osłabienia wiązania
między zasadą a dezoksyrybozą. Późniejsze dodanie piperydyny powoduje
rozszczepienie wiązania glikozydowego w wyniku czego zasada azotowa
ulega usunięciu. Odszczepieniu ulega dezoksyryboza i nić DNA zostaje
w tym miejscu rozerwana [1]. Dla przykładu, dodanie ograniczonej ilości
siarczanu dimetylu, sprawia że w poszczególnych cząsteczkach metylowana
będzie całkowicie losowo tylko jedna guanina. Późniejsze dodanie piperydyny
powoduje usunięcie zmetylowanej zasady G i przecięcie ssDNA
(ang.
single stranded Deoxyribonucleic Acid)
przed miejscem w którym
znajdowała się zasada G. W wyniku takich działań uzyskuje się zbiór
cząsteczek wyznakowanych radioaktywną grupą fosforanową na końcu 5`
i różniących się długością na końcu 3`. W momencie uzyskania zbioru
cząsteczek dla wszystkich próbek, poddaje się go rozdziałowi elektro-
foretycznemu w żelu poliakrylamidowym. Wyznakowanie radioaktywną
142
Sekwencjonowanie DNA – przegląd metod
grupą fosforanową na końcu 5` umożliwia wizualizację wyników przy
użyciu autoradiografii [6].
Rys. 1. Autoradiogram [6- zmodyfikowano]
Uzyskany autoradiogram (rys.1.) odczytuje się od dołu. Prążek
znajdujący się najniżej odpowiada najmniejszej cząsteczce DNA. Prążek
znajdujący się w ścieżce A+G i brak prążka w ścieżce G daje nam
informacje że pierwszym nukleotydem w badanej sekwencji jest nukleotyd
A. Kolejny nukleotyd to C ponieważ prążek występuje zarówno w ścieżce
C jak C+T. W taki sposób przesuwając się w odczycie autoradiogramu
w górę odczytujemy sekwencje badanej cząsteczki DNA [1].
Metoda chemicznej degradacji DNA jest metodą sprawiającą trudności,
między innymi z powodu używania odczynników chemicznych dlatego
naukowcy odeszli od jej używania. W 1977 roku powstała alternatywna
metoda opracowana przez Fredericka Sangera[2,7]
143
Karol Nowosad, Piotr Stępień, Paula Musiał
2.2. Metoda terminacji syntezy łańcucha DNA
Metoda terminacji syntezy łańcucha DNA nazywana metodą Sangera
lub metodą dideoksy opiera się na podobnej zasadzie jak metoda Maxam-
Gilberta tzn., na uzyskaniu zbioru cząsteczek DNA zakończonych
konkretnym nukleotydem, różniących się długością o jeden nukleotyd [2].
Sposób w jaki uzyskuje się tą pulę cząsteczek jest podstawową różnicą
między tymi dwoma metodami. Metoda Maxam-Gilberta oparta jest na
degradacji cząsteczki DNA a metoda Sangera oparta jest na syntezie nowej
nici DNA [1,2]. W klasycznej metodzie Sangera materiałem wyjściowym
do sekwencjonowania jest ssDNA. W celu otrzymania ssDNA najpierw
należy sklonować badaną cząsteczkę DNA w wektorze umożliwiającym
uzyskanie jednoniciowych matryc. Do tego celu można użyć wektora
fagowego M13 lub fagemidu [6]. Metoda dideoksy opiera się na syntezie
cząsteczki DNA
de novo.
W klasycznej metodzie Sangera do syntezy nici
DNA używa się fragmentu Klenowa polimerazy DNA I. Polimeraza ta
pozbawiona jest fragmentu N-końcowej domeny w wyniku czego nie
posiada właściwości 5`-3` egzonukleolitycznej. Fragment Klenowa cechuje
się niską procesywnością. Oprócz zwykłych dNTP, potrzebne do tej reakcji
są wyznakowane radioaktywnymi izotopami dNTP, umożliwiające
wizualizację cząsteczki DNA na autoradiogramie. Ważnym elementem
w tej metodyce jest dodanie w ograniczonej ilości trifosforanów dideo-
ksynukleozydów (ddTTP, ddGTP, ddCTP i ddATP). Charakterystyczną
cechą ddNTP jest brak na końcu 3` grupy hydroksylowej. Można określić
ddNTP jako terminator syntezy DNA. W klasycznej metodzie Sangera
przeprowadza się cztery reakcje w probówkach które zawierają wszystkie
elementy potrzebne do przeprowadzenia syntezy
de novo,
różnią się
jedynie tym że do każdej z nich dodawany jest inny dideoksynukleotyd.
Rozpoczyna się synteza nici komplementarnych. Polimeraza dobudowuje
nukleotydy na zasadzie komplementarności, zarówno zwykłe dNTP jak
również wyznakowane dNTP radioaktywnymi izotopami. W momencie
gdy polimeraza doda ddNTP dochodzi do zatrzymania syntezy nici DNA.
W wyniku tego otrzymujemy zsyntetyzowaną nić DNA o której wiemy, że
w danej probówce zakończona jest użytym ddNTP. Czas reakcji oraz
stosunek stężenia dNTP do ddNTP dobrany jest w taki sposób, aby
otrzymać w danej probówce zbiór fragmentów DNA różniących się długością
o jeden nukleotyd zakończonych określonym ddNTP. Mieszaniny reakcyjne
z czterech probówek poddaje się elektroforezie w żelu poliakrylamidowym
[8,9]. Wyniki rozdziału elektroforetycznego wizualizowane są poprzez
autoradiografię. Uzyskany autoradiogram analizowany jest od dołu, czyli
od cząsteczki której synteza zakończyła się na pierwszym nukleotydzie od
144
Sekwencjonowanie DNA – przegląd metod
startera. Po przeanalizowaniu całego autoradiogramu uzyskuje się
sekwencje badanej cząsteczki DNA [2].
W klasycznej metodzie Sangera można odczytać kilkaset nukleotydów.
Analiza sekwencji DNA klasyczną metodą Sangera jest bardzo
pracochłonna. Przyczyniło się to do powstania metody sprawniejszej
i mniej czasochłonnej [7].
2.3. Sekwencjonowanie cykliczne
Sekwencjonowanie cykliczne jest to zmodyfikowana postać metody
Sangera. Idea tej metody jest podobna do metody dideoksy. W celu
uzyskania puli fragmentów DNA różniących się długością o jeden
nukleotyd, zakończonych zdefiniowanym nukleotydem wykorzystano
rekcję PCR (ang.
polymerase chain reaction).
W reakcji PCR wykorzystywana
jest zmodyfikowana, termostabilna polimeraza Taq, której powinowactwo
do ddNTP jest takie samo jak do dNTP. Zastosowanie jednego rodzaju
startera prowadzi do amplifikacji jednej nici DNA. Jest to modyfikacja
klasycznej reakcji PCR nazywana asymetrycznym PCR. Dzięki
zastosowaniu reakcji PCR materiałem wyjściowym może być ssDNA, jak
również dsDNA. Jest to znacząca różnica pomiędzy sekwencjonowaniem
cyklicznym, a metodą Sangera. Krokiem, który przyczynił się do
zautomatyzowania sekwencjonowania DNA było zastosowanie odpowiednio
wyznakowanych fluorescencyjnie ddNTP. Każdy rodzaj ddNTP został
wyznakowany innym fluoroforem. Istotnym elementem, który podczas
reakcji umożliwia uzyskanie odpowiedniej liczby fragmentów DNA
o różnej długości jest dobranie odpowiedniego stężenia ddNTP w roztworze.
Powinno być znacznie mniejsze od stężenia dNTP, co zmniejsza
prawdopodobieństwo dobudowania dideoksynukleotydu na samym
początku nowopowstającej nici DNA. Po zakończeniu reakcji uzyskany
materiał poddaje się elektroforezie w żelu poliakrylamidowym lub
elektroforezie kapilarnej. Sekwenatory wykorzystywane w tej technice
wyposażone są w laser, który jest źródłem światła. Działanie lasera
wzbudza znacznik fluorescencyjny, który powracając do stanu podstawowego
emituje światło o określonej długości fali, rejestrowane przez detektor.
W wyniku automatycznego sekwencjonowania uzyskujemy elektroferogram
Analiza uzyskanych danych umożliwia określenie sekwencji nukleotydów
w cząsteczce DNA [2,10].
145

Plik z chomika:

Inne pliki z tego folderu:

Inne foldery tego chomika:

Zgłoś jeśli naruszono regulamin